자연과학 자료등록 미생물 실험 자료등록 미생물의 현미경관찰 - gram positive, negative
[자연과학] [미생물 실험] 미생물의 현미경관찰 - gram positive, negative
[미생물 실험] 미생물의 현미경관찰 - gram positive, negative
▶ 실험 날짜 : 2013. 9. 30
▶ 실험 준비물
-실험기구 및 도구 : 현미경, Pipet, 알코올램프, 슬라이드 글라스, 커버글라스 ,펜
-crystal violet, iodine, 95%ethanol, safranine, emulsin oil
-관찰할 미생물 : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
▶ 실험과정
1. 프레파라트 제작하기
① 우선 준비된 4개의 슬라이드 글라스에 헷갈리지 않도록 펜으로 균주명을 적어놓는다.
그리고 프레파라트 제작 후 현미경 관찰과정에서 쉽게 균들을 관찰할 수 있게끔 펜으로 균을 놓을 곳의 뒷면에 원을 그려서 영역을 표시해준다.
② Smear- 4개의 튜브에 들어있는 각각의 균들을 Pipe... [미생물 실험] 미생물의 현미경관찰 - gram positive, negative
▶ 실험 날짜 : 2013. 9. 30
▶ 실험 준비물
-실험기구 및 도구 : 현미경, Pipet, 알코올램프, 슬라이드 글라스, 커버글라스 ,펜
-crystal violet, iodine, 95%ethanol, safranine, emulsin oil
-관찰할 미생물 : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
▶ 실험과정
1. 프레파라트 제작하기
① 우선 준비된 4개의 슬라이드 글라스에 헷갈리지 않도록 펜으로 균주명을 적어놓는다.
그리고 프레파라트 제작 후 현미경 관찰과정에서 쉽게 균들을 관찰할 수 있게끔 펜으로 균을 놓을 곳의 뒷면에 원을 그려서 영역을 표시해준다.
② Smear- 4개의 튜브에 들어있는 각각의 균들을 Pipet을 이용하여 일정량( 을 각각의 슬라이드 글라스 위에 놓는다. 사용한 피펫팁은 알코올램프에 살짝 데어주어서 균에 의한 오염을 방지한다.
③ 알코올램프를 켜고 균이 올려진 슬라이드글라스의 뒷면을 알코올램프에 물기가 없어질 때까지 살짝 가져다대댄다.
④ Staining- 먼저 준비된 Crystal violet을 슬라이드글라스위의 균에 놓는다.
⑤ washing- 약 1분후에 슬라이드 글라스의 뒷면을 약하게 흐르는 물에 대어줘서 Crystal violet을 씻겨준다.
⑥ iodine 처리 - iodine을 Pipet을 이용해서 슬라이드글라스위의 균에 놓는다.
⑦ washing- ethanol로 iodine을 씻겨낸다.
⑧ counter staining - safranin을 Pipet을 이용해서 슬라이드글라스위의 균에 놓는다.
⑨ washing - 약 1분후에 슬라이드 글라스의 뒷면을 약하게 흐르는 물에 대어줘서 safanin을 씻겨준다.
⑩ ①~⑨과정을 거친 4개의 슬라이드 글라스위에 끝쪽부터 대각선모양으로 커버글라스를 덮어준다.
2. 현미경으로 미생물관찰하기
① 준비된 프레파라트를 현미경위에 올려놓고 고정시켜준다.
② 앞서 프레파라트 뒷면에 표시한 곳을 빛의 양을 조절하고 미동,조동나사 등을 통해서 초점을 맞춰준다.
③ 낮은 배율(접안렌즈배율 X10, 대물렌즈배율 X4 = x40 )부터 시작하여 →(x100) →(x400) → 고배율(x1000)로 관찰한다.
▶ 결과 :
① E.coli (1000배율)
: Escherichia coli 는 대표적인 그람음성균으로써 에탄올에 의해서 지질층이 빠지게 되어서 대조 염색된 사프라닌의 색인 붉은빛으로 관찰되었다. 간균이기 때문에 막대모양 형태를 관찰할 수 있었다.
(관찰된 부분에서 검정색의 불규칙적인 막대모양이 산재하는 것은 크리스탈 바이올렛 으로 보인다.)
② Pseudomonas aeruginosa (1000배율)
: Pseudomonas aeruginosa는 그람음성균으로써 에탄올에 의해서 지질층이 빠지게되어서 대조염색된 사프라닌의 색인 붉은빛으로 관찰되었다. 간균으로 역시 막대모양형태로 관찰되었다.
③ Staphylococcus aureus
: Staphylococcus aureus 는 그람양성균으로써 그람염색법을 통해서 보라색을 보여야 했지만 염색과정이 제대로 이루어지지 않아서 다소 붉은색으로 관찰되었다. 구형형태 모양으로 관찰되었다.
④ Bacillus subtilis
: Bacillus subtilis 는 그람양성균으로써 그람염색법을 통해서 연한 보라색으로 관찰되었다. 간균으로 막대모양으로 관찰되었다.
▶ 고찰
① 프레파라트 준비과정 중에서 슬라이드글라스 뒷면에 펜으로 미생물을 놓을곳을 확연히 표시해놓았어야 하는데 washing 과정 중에 부분적으로 지워져서 현미경으로 관찰시 어려움이 있었다.
⇒ 슬라이드 글라스의 넓은 영역에서 현미경을 통해 미생물을 빠르게 관찰하려면 미생물을 놓을 곳을 확실히 표시해놓아야 한다.
② 프레파라트 준비과정 중에서 pipetting을 하는 동작에서 단계적으로 조절하며 하지 않았기 때문에 미생물을 옮기는 과정에서 팁 안에 미생물이 남는 일이 발생하였다.
⇒정확한 pipetting 법을 숙지하고 있어야한다. (1단계`2단계 누름)
③ 현미경 관찰시 저배율(x40)부터 고배율 (x1000)까지 차근차근 관찰해야 하는데 중간배율부터 시작하면서 현미경으로 관찰하여 미생물 집단을 찾는데 어려움이 있었다.
⇒ 저배율(x40)에서 초점을 충분히 맞춰서 미생물 집단을 찾아낸 뒤에 단계적으로 x100, x400, x1000으로 고배율로 늘려가면서 초점을 맞추며 관찰해야 한다.
④ 현미경 관찰 결과 Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis 는 처음에 발견하였을 때 염색과정이 제대로 이루어지지 않아서 그람 양성균임에도 불구하고 붉은빛이 도는 것으로 발견되었다.
⇒ 현미경 관찰을 하면서 부분적으로 그람양성균임에도 불구하고 붉은 색이보인 것은 ‘washing`과정 중에 문제가 있었을 것이다. 탈색을 오랜 시간 진행하게 되면 그람양성균이어도 크리스탈 바이올렛과 요오드의 복합체가 빠져나가게 되어 버린다. 그 결과 그람양성균도 탈색된 자리에 사프라닌이 다시 염색되어 핑크 빛을 띠게 된다. 따라서 ’washing`과정은 너무 오랫동안에 하지 않아야 하며 강한 물줄기에 직접적으로 씻어서도 안된다.
⑤ 염색물질이 washing 과정중에 충분히 씻겨나가지 않았기 때문에 그람 음성균인 E.coli 가 붉은색을 띰에도 불구하고 진한 보라색을 띠는 염색물질을 균으로 착각하게 되었다.
⇒ 충분한 ‘washing`이 이루어지지 않았기 때문에 염색물질이 많이 보이고 균과 헷갈리는 일이 발생하였다. 적당한 ’washing`과정이 이루어져야 한다.
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자료출처 : http://www.ALLReport.co.kr/search/detail.asp?pk=14080738&sid=qjfRnf777&key=
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